USP <85> « Test des endotoxines bactériennes »

Dans le cadre de la fabrication de médicaments parentéraux ou de dispositifs médicaux, le respect des normes réglementaires de contrôle de la contamination est une étape fondamentale pour assurer la sécurité des patients. Cet article détaille le chapitre <85> de la Pharmacopée des États-Unis (USP) intitulé « Test des endotoxines bactériennes » (BET).

Qu’est-ce que l’USP <85> et pourquoi est-ce important ?

L’USP <85> décrit les exigences officinales pour les tests des endotoxines bactériennes. Il fournit les méthodologies permettant de détecter ou de quantifier les endotoxines à l’aide de lysat d’amoebocyte, un composé extrait d’espèces de limules telles que Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus. Ces types de lysat sont généralement appelés lysat d’amibocytes de limule (LAL) ou lysat d’amibocytes tachypleus (TAL).

 

Pourquoi tester les endotoxines bactériennes ?

Les endotoxines sont des biocontaminants dérivés de la membrane cellulaire externe des bactéries à Gram négatif. Bien qu’ils ne soient pas des organismes vivants, ce sont des pyrogènes très dangereux qui peuvent produire de la fièvre dans le corps lorsqu’ils contournent les défenses digestives normales. De plus, ils peuvent provoquer une chute sévère de la pression artérielle, une défaillance d’organe, un choc septique ou même la mort, dans certaines circonstances.

Étant donné que les endotoxines persistent même après les processus d’assainissement et de stérilisation standard, des tests rigoureux sont absolument essentiels pour les produits et les dispositifs d’administration qui entrent en contact avec la circulation sanguine ou le liquide céphalo-rachidien.

Qui est concerné par l’USP <85> ?

Les organismes de réglementation comme la Federal Drug Administration (FDA) des États-Unis et l’Agence européenne des médicaments (EMA) exigent des tests d’endotoxines pour s’assurer que les produits ne provoquent pas de réactions pyrogéniques comme celles décrites ci-dessus. Leurs réglementations s’appliquent à de multiples industries, notamment :

• Les fabricants de produits pharmaceutiques qui produisent des médicaments parentéraux administrés par voie intraveineuse, intramusculaire et intrathécale.
• Les fabricants de dispositifs médicaux dont les produits entrent en contact avec la circulation sanguine.
• Les fabricants de produits de santé animale produisant des articles vétérinaires en contact avec le sang.

Remarque - cette liste n’est pas exhaustive.

Méthodes de détection des endotoxines USP <85>

En plus des exigences officinales de l’USP <85> décrivant les méthodologies de détection ou de quantification des endotoxines à l’aide de LAL, le chapitre décrit également les facteurs qui peuvent avoir une incidence sur les résultats en créant des incohérences ou des résultats inexacts. Bien qu’il ne détaille pas comment gérer ou atténuer ces aspects, il souligne l’importance d’un développement approfondi de la méthode dans le cadre de la validation. Des informations sur l’interprétation et l’application des exigences de l’USP <85> sont disponibles dans l’USP <1085> « Guide des tests des endotoxines ».

Méthodes de détection

L’USP <85> détaille trois techniques courantes pour les tests d’endotoxines et la façon dont elles génèrent des données ; les réactifs nécessaires ; et comment s’assurer que l'essai est exécuté de manière à ce que les procédures et les matériaux ne contribuent pas à une contamination potentielle ou à des résultats erronés.

Les trois méthodes sont les suivantes :

1. Technique de gélification : Cette méthode qualitative ou semi-quantitative est basée sur la coagulation des réactifs de lysat en présence d’endotoxines.
2. Technique turbidimétrique : Essai photométrique qui mesure l’évolution de la turbidité (changement d’opacité) après le clivage d’un substrat endogène.
3. Technique chromogénique : Un test photométrique basé sur le développement de la couleur après le clivage d’un complexe peptide-chromogène synthétique.

 

Télécharger maintenant : Comment fonctionnent les différentes plateformes de test des endotoxines - Un résumé des systèmes de test chromogène cinétique

Télécharger maintenant : Détermination des valeurs équivalentes de densité optique de départ (DO)

Adéquation de la méthode BET et adéquation spécifique au produit selon USP <85>

L’adéquation d’une méthode est un processus de validation qui confirme qu’une méthode de test des endotoxines bactériennes est appropriée et fiable pour un produit ou une application spécifique, avant qu’elle ne soit utilisée pour des tests de routine.

Que faut-il prendre en compte lors de l’élaboration de l’adéquation de la méthode ?

Les dosages d’endotoxines sont très sensibles. L’élaboration et l’adéquation de la méthode sont souvent propres au produit afin de documenter qu’un médicament, un dispositif ou une matière première n’interfère pas avec la réaction et sa méthode de détection et garantir des résultats valides. L’adéquation de la méthode permet des tests d’endotoxines bactériennes fiables, valides et conformes à la réglementation.

Critères d’acceptation

Les seuils d’innocuité des produits pharmaceutiques ne sont pas universels. Des aspects tels que le dosage, la durée d’utilisation et le mode d'administration du produit sont pris en compte dans les critères d’acceptation.

Les fabricants doivent calculer une limite d’endotoxines (LE) pour chaque produit en fonction de la façon dont il pénètre dans l’organisme. La formule utilisée est la suivante :

EL = K / M

Dans cette équation, K représente la limite de tolérance de l’organisme (le « seuil de sécurité »), tandis que M représente le « pire scénario », c’est-à-dire la dose maximale de médicament qu’un patient pourrait recevoir par kilogramme de poids corporel par heure.

Le facteur K change radicalement en fonction de la voie d’administration. Par exemple, les produits intraveineux (IV) ou intramusculaires (IM) sont définis comme des médicaments pénétrant dans la circulation sanguine ou les muscles. La limite de tolérance pour les produits IV et IM est plus élevée car le risque est plus faible en raison du type d’administration. En comparaison, les médicaments injectés directement dans la moelle épinière ou le cerveau, appelés médicaments intrathécaux (IT), ont généralement une limite de tolérance inférieure, car le risque d’effet indésirable est plus élevé. Cela signifie qu’un médicament pour la colonne vertébrale doit contenir une charge d’endotoxines inférieure à celle d’une perfusion intraveineuse standard.

De plus, il existe des calculs supplémentaires qui tiennent compte du fait qu’un médicament est une dose unique ou un goutte-à-goutte continu, car le taux d’administration modifie le profil de risque. Ces calculs prennent en compte des facteurs tels que le poids ou le type de patient. Les calculs basés sur le poids sont également la raison pour laquelle les médicaments pédiatriques et vétérinaires ont souvent des EL significativement plus faibles, car les patients plus petits ont un seuil d’exposition aux endotoxines plus bas.

Cela fera partie des calculs de dilution maximale valide (MVD), comme décrit ci-dessous.

Sensibilité du LAL

Le lysat présente plusieurs facteurs qui contribuent à l’incohérence de la sensibilité.

Le LAL n’est pas un composé unique, mais un mélange d’enzymes produites par les amébocytes, chacune contribuant à la réaction en cascade. En raison du fait qu’elles sont produites dans la nature, ces enzymes peuvent varier en quantité et en sensibilité et manquer de la cohérence habituelle dans les réactifs manufacturés.

La cascade LAL est un système d’amplification enzymatique très sensible qui détecte les endotoxines par le biais d’une série d’activations enzymatiques et permet une détection rapide et spécifique des endotoxines. La réaction en cascade est la raison pour laquelle les tests LAL sont la référence en matière de détection des endotoxines bactériennes dans les industries réglementées.

 

Il est important de tenir compte de la variabilité potentielle, car elle a un impact sur les résultats et compromet la reproductibilité des expériences. La variation est un facteur dans les calculs de dilution maximale valide (MVD), qui est symbolisée par λ.

Le LAL commence à réagir et à se dégrader immédiatement après sa reconstitution. La réfrigération ralentira l’activité mais n’arrêtera pas la dégradation. Cette variation doit être prise en compte dans chaque essai et peut être réalisée de la manière suivante :

• * Une courbe standard : Étalonnage de la réactivité du réactif actuel à l’aide d’un minimum de 3 points (ou 4 pour la méthode par gélification).
• * Des contrôles positifs de produits (PPC) : Les échantillons ont été enrichis d’une quantité connue d’endotoxine pour prouver que le test peut réellement la détecter dans ce médicament spécifique.
• * Des contrôles négatifs : le LAL mélangé à de l’eau réactive au LAL (LRW) pour définir une base de référence.

L’instabilité du LAL peut être observée dans les témoins négatifs. Si on leur laisse suffisamment de temps, ils finiront par réagir. Cette sensibilité inhérente est la raison pour laquelle le test est si efficace, mais il exige une discipline procédurale.

Limite d’endotoxine et dilution maximale valide (MVD)

La dilution maximale valide (MVD) est la dilution maximale admissible d’un échantillon à partir de laquelle la limite d’endotoxine peut être déterminée. Elle prend en compte à la fois le calcul de la limite d’endotoxine et la sensibilité du LAL, mais fournit le facteur de dilution pour éviter les interférences.

MVD = (limite d’endotoxine (EL) × concentration de la solution d’échantillon)/(λ)

λ est la sensibilité marquée du lysat ou la concentration la plus faible utilisée dans la courbe standard.

Ce calcul tient compte du fait que les échantillons peuvent contenir des substances qui inhibent la détection des endotoxines (provoquant des faux négatifs) ou l’améliorent (provoquant des faux positifs).

Matériaux, accessoires et leur impact sur les tests d’endotoxines

 

La source d’interférence potentielle s’étend au-delà de l’échantillon lui-même, et une manipulation appropriée de l’échantillon est un facteur qui a un impact sur la précision du test.

Les matériaux utilisés pour le prélèvement et l’entreposage des échantillons sont susceptibles d’introduire une contamination. L’USP <85> souligne que :

• Le matériel conçu pour être réutilisé, comme les plateaux métalliques, doit être dépyrogéné.
• Des articles tels que les pointes de pipette, les tubes de dilution et les microplaques doivent être examinés pour confirmer qu’ils sont exempts d’endotoxines détectables, soit en se fiant au certificat d’analyse (CoA) d’un fournisseur, soit en effectuant des tests internes.
• On sait que certains matériaux, tels que les pipettes sérologiques en plastique, peuvent provoquer des interférences et ils doivent donc être évités.

Il est recommandé que les protocoles d’essai évitent d’utiliser des accessoires contenant des plastiques tels que le polypropylène, car il est connu pour adsorber les endotoxines et pourrait entraîner une sous-estimation.

En ce qui concerne les endotoxines, un faux négatif est particulièrement dangereux pour la sécurité des patients, car les réactions pyrogéniques peuvent être graves.

Télécharger maintenant : Sélection et criblage des accessoires et des matériaux dans BET

Contamination par le bêta-glucane

Les bêta-glucanes (β-glucanes) peuvent être introduits lorsque du matériel végétal ou un champignon est introduit dans le cadre de la préparation de l’échantillon, par exemple à l’aide d’un embout de pipette à filtre.

Les bêta-glucanes sont des glucides complexes composés de molécules de glucose liées par des liaisons β-glycosidiques. Également connus sous le nom de polysaccharides, ils sont naturellement présents dans d’innombrables organismes, notamment les levures, les champignons, les bactéries, les algues et les céréales comme l’avoine et l’orge. Les champignons et les levures contiennent les concentrations les plus élevées de bêta-glucanes, et leur prévalence signifie que le risque de contamination est important.

Les bêta-glucanes interfèrent avec les résultats, provoquant des faux positifs en activant le LAL par une voie différente de celle des endotoxines.

Surmonter les interférences du TEB

L’USP <85> exige que les facteurs d’interférence soient pris en compte dans le cadre de l’élaboration de la méthode, et que la récupération se situe dans la fourchette de 50 % à 200 %. Si la récupération se situe en dehors de cette plage, il y a interférence.

Les interférences peuvent souvent être surmontées des façons suivantes :

• Dilution de l’échantillon, mais la dilution ne doit pas dépasser la MVD
• Application de traitements appropriés validés tels que la filtration, la neutralisation, la dialyse ou le traitement thermique
• Utilisation d’un tampon bloquant le glucane en cas de présence de bêta-glucanes, car le LAL peut parfois réagir aux glucanes en plus des endotoxines

 

Télécharger maintenant : Protocole d’inhibition/d’amélioration pour les tests d’endotoxines bactériennes

Intégrité des données et TEB

Les tests traditionnels, en particulier avec la méthode de gélification, sont manuels à la fois dans les opérations et dans la détermination du point final. Pour ce test, la création d’un caillot est confirmée par l’inspection visuelle du tube. Cette nature manuelle est non seulement chronophage, mais elle est ouverte à l’interprétation, ce qui la rend sujette à l’erreur humaine. Cela peut potentiellement compromettre l’intégrité des données.

Pour atténuer ces risques, les laboratoires se tournent vers des tests avec des données quantitatives. Ces plateformes effectuent plusieurs relevés à l’aide d’un logiciel conforme et fournissent une transmission sécurisée des données, des pistes d’audit complètes spécifiques aux tests et le strict respect des normes 21 CFR Part 11 et ALCOA+ en matière de conformité concernant l’intégrité des données. De plus, ces options offrent une gamme de possibilités d’automatisation, y compris la dilution des échantillons et le pipetage.

Vous voulez en savoir plus sur les technologies actuelles en matière de tests d’endotoxines, y compris les nouvelles approches qui réduisent les taux de répétition des analyses ?

Télécharger maintenant : L’automatisation du TEB simplifiée

Nous pouvons vous aider à respecter l’USP <85>

Le respect de l’USP <85> peut être complexe et prendre beaucoup de temps. Lors de la mise en œuvre de la plateforme de test d’endotoxines bactériennes Sievers Eclipse, nos spécialistes du TEB deviennent vos partenaires d’installation et de mise en œuvre. Des études de faisabilité à la validation des méthodes en passant par l’élaboration des SOP, notre équipe peut vous aider à rationaliser le déploiement tout en garantissant une conformité transparente tout au long de l'adoption de la plateforme.

Sievers Eclipse fournit une détection rapide et quantitative des endotoxines qui donne aux installations de toutes tailles l’efficacité, la fiabilité et la confiance en matière de conformité dont elles ont besoin. Découvrez les témoignages de nos clients.

 

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Télécharger maintenant : Comparaison entre la plateforme de TEB Sievers Eclipse et les tests sur microplaques à 96 puits : délais et résultats

Télécharger maintenant : Évaluation du stockage des réactifs LAL à l’aide de la plateforme de TEB Sievers Eclipse

 

Auteurs :

Meg Provenzano 

Meg Provenzano est cheffe de produit mondiale pour les instruments d’endotoxine Sievers chez Veolia. Elle possède plus de 10 ans d'expérience dans le secteur des tests d'endotoxines bactériennes et a occupé plusieurs postes liés au contrôle de la qualité, à l'assistance technique et à la gestion des produits. Avant de rejoindre Veolia, Meg était chef de produit chez Charles River Laboratories. Elle est attentive aux besoins des clients et aime résoudre les problèmes sur le terrain, qu’il s’agisse de questions techniques, d’aide à l’analyse ou de logiciels. Meg est titulaire d'une licence en sciences et biologie marines de l'université de Coastal Carolina, où elle s'est spécialisée sur la recherche concernant les populations de dauphins.

Sydney Jannetta

est responsable marketing chez Veolia, spécialiste de la gamme d’instruments d’analyse Sievers. Sydney a soutenu les clients de Sievers au cours des dix dernières années grâce à son expertise dans les applications de carbone organique total (COT) et d’endotoxines. Elle a fourni des services de développement de méthodes et d’essais de faisabilité à des fabricants de produits pharmaceutiques et a fait des présentations dans plus de 20 conférences nationales. Sydney est titulaire d’une licence en chimie de l’Université du Colorado du Nord.

Lindsey Wohlman

est spécialiste du marketing chez Veolia et se consacre à la gamme d’instruments d’analyse Sievers. Elle collabore étroitement avec des ingénieurs, des scientifiques et des experts en produits pour développer du contenu qui transforme les contenus techniques en informations pratiques pour les clients et les parties prenantes de B2B. Son expérience en tant que spécialiste du marketing numérique dans les domaines de la technologie, des logiciels et de la fabrication lui a permis d’apprécier profondément le rôle que joue une communication claire dans la compréhension et l’instauration de la confiance. Lindsey est titulaire de deux Bachelor of Arts de l’Université du Colorado.