Plateforme de test d'endotoxines bactériennes (TEB) Eclipse de Sievers

Foire aux questions (FAQ) sur les tests d’endotoxines bactériennes avec Eclipse

Qu’est-ce que le test d’endotoxines bactériennes ?

Le test des endotoxines bactériennes consiste en une procédure essentielle de contrôle de la qualité utilisée dans les industries pharmaceutiques, les dispositifs médicaux et la biotechnologie dans le but de détecter et de quantifier la présence d’endotoxines dans divers produits. Les endotoxines sont des composants de la membrane cellulaire externe des bactéries à Gram négatif et peuvent provoquer de graves réponses immunitaires chez les humains et les animaux, même en petites quantités.

Que sont les endotoxines bactériennes ?

Les endotoxines bactériennes se trouvent dans la membrane externe da la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif. L’effet de l’endotoxine des bactéries à Gram négatif est principalement dû au composant lipidique A des lipopolysaccharides (LPS), qui peut exercer des réponses pyrogéniques (qui provoquent de la fièvre) éventuellement dangereuses. Les conséquences peuvent même être mortelles lorsque le composant se retrouve dans la circulation sanguine et autres fluides corporels au-delà d'une certaine quantité. Certains produits pharmaceutiques et appareils médicaux pouvant pénétrer dans la circulation sanguine, des tests d'endotoxines sont requis dans ces industries. En raison de sa toxicité élevée et de ses effets sur la sécurité des patients, l'endotoxine est régulée par la FDA aux Etats-Unis ainsi que par la pharmacopée internationale pour tous les produits des sciences de la vie pouvant entrer en contact avec le sang humain et/ou animal.

Pourquoi faire des tests de recherche des endotoxines bactériennes dans l'eau ou les produits finis ?

Dans les domaines pharmaceutiques et des appareils médicaux, ainsi que dans les industries des sciences de la vie, les tests de recherche d'endotoxines sont cruciaux pour la sécurité des patients et le contrôle de la qualité. Les tests de recherche d’endotoxines sont effectués sur les systèmes d’eau de qualité pharmaceutique, y compris l’eau pour injection (WFI) utilisée comme eau de fabrication, et les produits finis tels que les médicaments, les médicaments vétérinaires, les produits biologiques et les dispositifs médicaux. Les produits pharmaceutiques et médicaux testés incluent les médicaments à usage parentéral (administrés par injection par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire et intradermique, par exemple), et les appareils médicaux en contact direct ou indirect avec le sang, le système cardiovasculaire, le système lymphatique, ou le fluide cérébrospinal. La pharmacopée internationale (USP <85>, PE 2.6.14 et JP 4.01) définit les exigences applicables aux Tests d'Endotoxine Bactérienne (TEB) et aux seuils autorisés. La FDA émet des recommandations pour les fabricants de produits biologiques, de médicaments et d'appareils médicaux sur le raisonnement actuel concernant les directives de test et les critères d'acceptation couverts par les procédures officinales.

Comment fonctionne la méthode de test des endotoxines bactériennes ?

Depuis près de 40 ans, la FDA américaine accepte le test de lysat d'amébocyte de limule (LAL) comme test de recherche d'endotoxine sur les produits finis. Ce test remplace celui d'apyrogénicité sur les lapins et constitue un test in vitro pouvant détecter la présence et la concentration des endotoxines bactériennes. Dans les tests LAL, le lysat de limules (Limulus Polyphemus) réagit aux endotoxines bactériennes pour indiquer la présence  d'endotoxines dans un échantillon. Il existe trois grandes méthodologies de test d'endotoxines bactériennes pour les tests LAL : par gélification, par turbidimétrie et par chromogénie. Dans la méthode par gélification, le LAL et l'échantillon sont mélangés, puis analysés pour la formation du gel dans le tube de réaction. Les résultats découlent d'une interprétation subjective de la formation du caillot, et la méthode par gélification constitue donc un test qualitatif. Dans les méthodes par turbidimétrie et chromogénie, les échantillons sont mélangés avec le réactif LAL, et le changement de couleur ou la turbidité sont mesurés sur la durée. Les tests chromogéniques et turbidimétriques sont quantitatifs et démontrent la quantité d'endotoxines présente. Les résultats sont calculés à partir d'une courbe standard. Endotoxin limits and requirements for conducting BET are described in global pharmacopeia, USP <85>, EP 2.6.14 and JP 4.01. Un nouveau chapitre général dans la Pharmacopée européenne décrit une méthode TEB utilisant un facteur C recombinant (rFC) au lieu de la méthode classique à base de LAL.

En quoi la plateforme Sievers Eclipse diffère-t-elle des tests traditionnels sur microplaques à 96 puits ?

L’analyse traditionnelle des microplaques à 96 puits nécessite une formation approfondie, du temps de mise en place et un pipetage manuel répétitif (jusqu’à 242 étapes pour 21 échantillons), ce qui prend du temps, est sujet à l’erreur humaine et constitue une contrainte ergonomique pour les analystes. La plateforme Sievers Eclipse utilise l’automatisation microfluidique pour simplifier considérablement le processus, nécessitant moins de 30 étapes de pipetage pour charger une microplaque complète. Cela réduit le temps de préparation du test d’environ une heure à environ 9 minutes.

Comment fonctionne l’automatisation microfluidique sur la microplaque Sievers Eclipse ?

La microplaque Eclipse utilise la force centrifuge ainsi qu’un réseau de microcanaux, de chambres de dosage et de chambres pneumatiques. Au fur et à mesure que la microplaque tourne à l’intérieur de l’analyseur, le système distribue automatiquement et précisément les échantillons, le lysat et l’eau dans 104 puits optiques individuels. Cette manipulation précise des liquides garantit un rapport échantillon/réactif parfait de 1:1 dans chaque puits sans avoir besoin d’une robotique complexe, garantissant ainsi une biochimie cohérente.

Quelle est la quantité de réactif LAL utilisée sur la plateforme TEB de Sievers Eclipse ?

1 mL de réactif LAL permettent de traiter 21 échantillons sur la plateforme Eclipse. En diminuant l’utilisation de lysat de limulidae (HSC) jusqu’à 90 %, l’Eclipse réduit la demande de cette ressource naturelle précieuse et fournit un test TEB entièrement conforme que la population HSC mondiale peut maintenir.

Puis-je utiliser des réactifs recombinants d'origine non animale sur la plateforme Sievers Eclipse ?

Oui, la plateforme Eclipse est entièrement compatible avec les réactifs en cascade recombinants (rCR) d’origine non animale, ce qui permet de se conformer aux nouvelles directives USP <86>. Des études comparant la rCR et le LAL traditionnel sur l’Eclipse ont démontré des performances équivalentes pour les étalons hautement purifiés et les endotoxines naturelles (NOE) dans des échantillons réels.

La plateforme TEB de Sievers Eclipse est-elle conforme ?

Oui. La plateforme Eclipse utilise des LAL disponibles dans le commerce et autorisés par la FDA et répond à toutes les exigences de la pharmacopée mondiale harmonisée, USP <85>, EP 2.6.14, JP 4.01 et ChP 1143. Les tests d’endotoxines bactériennes avec la plateforme Eclipse comprennent une courbe standard minimale de trois points en double utilisant une endotoxine normalisée ;des échantillons et PPC en double exemplaire ; des contrôles négatifs en double ; la qualification des lots d’analystes et de lysats en triple exemplaire ; l’utilisation de LAL autorisés par la FDA. Ces tests sont également conformes à la norme 21 CFR Part 11 et aux directives sur l'intégrité des données.

La plateforme TEB Sievers Eclipse est-elle conforme aux directives réglementaires mondiales ?

Oui, la plateforme Sievers Eclipse est entièrement conforme aux pharmacopées mondiales harmonisées, notamment USP <85>, EP 2.6.14, JP 4.01 et ChP 1143. De plus, son logiciel d’entreprise est conçu spécifiquement pour respecter les principes ALCOA+ et les exigences de la norme 21 CFR Part 11, offrant une transmission sécurisée des données, des autorisations utilisateur personnalisables et des pistes d’audit spécifiques aux tests avec signatures électroniques.

Les courbes standard sont-elles automatisées à l'aide de Sievers Eclipse ?

Oui. De façon traditionnelle, pour obtenir des tests d'endotoxines conformes, l'utilisateur final doit élaborer une courbe standard d'au moins trois points en double à partir d'un flacon d'endotoxine normalisée ; doit disposer de contrôles négatifs en double ; et doit exécuter chaque échantillon en double avec un PPC, également en double.  Avec la plateforme TEB Sievers Eclipse, ces étapes sont automatisées à l'aide de normes d'endotoxines préchargées pouvant aller jusqu'à des courbes standard de cinq points et des PPC préchargés.  Par conséquent, il suffit à l'utilisateur final de charger de l'eau pour le TEB et les échantillons sur la plaque. Aucune préparation supplémentaire n'est requise.  Il est donc possible de configurer le test en 9 minutes, alors que les autres plateformes peuvent nécessiter jusqu'à 60 minutes.

Dois-je créer manuellement des courbes standard et des contrôles positifs de produits (PPC) avec Sievers Eclipse ?

Non, la microplaque Eclipse est préchargée avec une endotoxine étalon de référence (RSE) s’étendant jusqu’à une courbe standard de 5 points (p. ex., 50 à 0,005 EU/mL en triple) et des PPC pré-déposés pour chaque échantillon. Étant donné que ces éléments critiques sont intégrés lors de la fabrication, il suffit à l'analyste d'ajouter de l’eau de réactif LAL ou de l’eau pour BET, des échantillons de test et 1 ml de réactif pour commencer le test.

Est-il difficile de former des analystes et de valider le système Sievers Eclipse dans mon laboratoire ?

Non, la mise en œuvre du système de test d’endotoxines Sievers Eclipse est très simple. Étant donné que la microfluidique automatise les tâches de pipetage les plus complexes, un analyste peut être formé et certifié sur l’Eclipse en une seule journée, un processus qui prend généralement des semaines, voire des mois. La validation du système est tout aussi efficace, car la plateforme est livrée avec un package complet d’assistance à la validation IQ/OQ/PQ qui permet à l’instrument d’être entièrement validé et intégré dans un laboratoire en quelques jours seulement.

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