Aujourd’hui, la plupart des fabricants de produits pharmaceutiques et de dispositifs médicaux utilisent le lysat d’amébocytes de limule (LAL), le sang des limules, pour rechercher la présence d’endotoxines bactériennes. Les tests sont essentiels pour détecter les contaminants dangereux et potentiellement mortels, mais, sur le plan de la durabilité, ils exercent une pression sur la population de limules. Les crabes sont le réactif de détection d’endotoxines naturelles le plus sensible et le plus inégalé de la planète. La plupart de ceux qui sont collectés et saignés par l’industrie biomédicale sont, comme l’exige l’usine de gestion des pêches (PGP), relâchés vivants dans l’eau d’où ils ont été prélevés. Cependant, une partie de ces crabes meurent des suites de la procédure1. Pour cette raison, des méthodes alternatives d’endotoxines bactériennes ont évolué ces dernières années. Le facteur C recombinant (rFC) et les réactifs en cascade recombinants (rCR) sont deux méthodes alternatives qui n’utilisent pas de sang de limule.
La rFC est la première enzyme de coagulation dans le mécanisme de coagulation sanguine de la limule, et un clone de ce facteur C est utilisé pour la méthode rFC. Il fonctionne en demandant à un lecteur de fluorescence d’amplifier un substrat fluorogène pour détecter la présence d’endotoxine. La FDA a reconnu la rFC comme une méthode alternative, mais exige des tests d’équivalence par rapport aux méthodes BET officinales plus courantes, conformément aux exigences de l’USP <85>Bacterial Endotoxins Test et du chapitre USP <1225>Validation des procédures officinales2.
Les réactifs en cascade recombinants, ou rCR, utilisent les mêmes facteurs que les réactifs LAL traditionnels présents dans le sang de limule, mais en utilisant un procédé de fabrication recombinant3, ils sont considérés comme une méthode alternative. L’utilisation d’un réactif recombinant contient tous les facteurs de coagulation et utilise un test cinétique traditionnel sur un lecteur d’absorbance, ce qui en fait un test non-animal pour le BET. Les entreprises qui adoptent cette méthode d’essai doivent également se soumettre aux mêmes tests de validation/d’équivalence que les rFC.
Bien que ces méthodes soient moins meurtrières pour la population de limules, la validation et la mise en œuvre d’une méthode alternative pour le TEB peuvent prendre du temps et être rigoureuses, et obligent de nombreuses entreprises à rechercher une option plus simple, mais également durable, pour tester la présence d'endotoxines dans les produits.
La plateforme de test d’endotoxines bactériennes (TEB) Eclipse de Sievers est une solution qui offre des avantages significatifs en termes de réduction des LAL et de respect des normes officinales. Bien qu'il ne s'agisse pas d'une méthode alternative, l'application d'un protocole complet de QI/QO/PQ et la réalisation d'essais et de validations robustes similaires aux exigences de l'USP <1225> permettront aux utilisateurs d'avoir une confiance totale dans la validation du produit. L’Eclipse utilise des LAL de limules disponibles dans le commerce et autorisés par la FDA, mais réduit l’utilisation de LAL jusqu’à 90 % par rapport aux méthodes LAL traditionnelles telles que la plaque à 96 puits et le caillot de gel. Lors du développement de l’Eclipse, une microplaque ultramoderne a été conçue pour faciliter une dispersion précise et rapide du LAL et des échantillons à l’aide de la force centripète, de chambres de dosage et de canaux microfluidiques. Le système microfluidique utilise la même biochimie que les tests d’endotoxine traditionnels, mais avec un minimum d’effort pratique, une plus grande consistance et une consommation de LAL considérablement réduite (jusqu’à 90 % comme mentionné.
La plateforme de test des endotoxines bactériennes (BET) Eclipse de Sievers est en passe de devenir une méthode de test TEB de choix, car elle permet aux fabricants de produits pharmaceutiques et de dispositifs médicaux de protéger des ressources naturelles précieuses et d’atteindre les objectifs de durabilité tout en se conformant aux exigences analytiques et réglementaires strictes de la pharmacopée mondiale harmonisée USP <85>, EP 2.6.14 et JP 4.01.
Comparaison des méthodes d’essai LAL
Auteur : Hayden Skalski - Spécialiste de l’application des produits pour les sciences de la vie, Veolia Water Technologies & Solutions, Sievers Instruments
Hayden est le spécialiste de l’application des produits des sciences de la vie pour la gamme de produits Sievers Instruments, spécialisé dans les tests d’endotoxines bactériennes (TEB). Hayden a plus de 8 ans d’expérience dans l’industrie pharmaceutique et le contrôle de la qualité microbiologique et a fait des présentations sur de nombreux sujets entourant les tests d’endotoxines. Auparavant, Hayden a occupé des postes chez Charles River Laboratories, Regeneron et Novartis, où il a validé et exécuté des protocoles de développement de méthodes pour les tests d’endotoxines, en assurant l'assistance à la clientèle, le dépannage et la prise en charge des tests de produits en grand volume. Hayden est titulaire d’un B.S. de l’Université d’Albany (SUNY) en biologie.
- Références
-
1. Commission des pêches maritimes des États de l’Atlantique. (s.d.). Limule. Extrait de http://www.asmfc.org/species/horseshoe-crab
2. Département de la santé et des services sociaux des États-Unis, Food and Drug Administration. (2012, juin). Lignes directrices à l’intention de l’industrie : Essais de pyrogénéité et d’endotoxine : questions et réponses
3. Associés de Cape Cod Incorporated. (s.d.). Mode d’emploi du réactif LAL recombinant PyroSmart NextGen™.